服務(wù)熱線
15201163601
-
TOXIN痢疾桿菌 試驗方法
發(fā)布時間： 2024-02-20 點擊次數(shù)： 895次北京華新康信年度推廣活動 TOXIN 上海試劑 TOXIN 湖北試劑 TOXIN 10280血漿對照 TOXIN 10280血漿對照
TOXIN 活動價TOXIN 活動價TOXIN 活動價 TOXIN 所有系列一站式采購 TOXIN 檢測試劑盒 TOXIN 檢測試劑盒 TOXIN 放線菌類 TOXIN 放線菌類胰蛋白 TOXIN 江蘇試劑 TOXIN 湖南試劑 TOXIN 所有系列一站式采購TOXIN 天津試劑 TOXIN 所有系列一站式采購 TOXIN 天津試劑 TOXIN 天津試劑 TOXIN 上海試劑 TOXIN 上海試劑 TOXIN 廣東試劑 TOXIN 廣東試劑
1.2 方法
1.2.1 黃連水提液的制備
稱取干燥黃連 10 g，超微粉碎，加入 200 mL 的超純水，浸泡 2 h，大火煎
至煮沸后文火，保持 30 min，紗布過濾；藥渣加溫水 300 mL，再大火煎至煮沸
后文火煎 30 min，過濾，合并濾液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 500 mL，10000 rpm
離心 15 min，離心取上清，定容至 100 mL，濃縮濃度為 100 mg·mL-1，用 0.22 μm
的除菌器過濾除菌，分裝 4℃冰箱保存。
1.2.2 高效液相色譜檢測黃連品質(zhì)
（1）色譜條件
色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4·6 mm，5 μm）；以乙腈—0.05 mol·L-1
磷酸二氫鉀溶液（50:50）（每 100 mL 中加十二垸基硫酸鈉 0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)
pH 值為 4.0）為流動相；檢測波長為 345 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。
（2）標準曲線
分別稱表小檗堿 0.0018 g，黃連堿 0.0037 g，巴馬汀 0.0024 g，鹽酸小堿
0.002 g，置于 100 mL 容量瓶中，用流動相定容，得表小檗堿濃度為 18 μg·mL-1，
黃連堿濃度為 37 μg·mL-1，巴馬汀濃度為 24 μg·mL-1，鹽酸小堿濃度為 20
μg·mL-1 的混合標準品母液。再分別稀釋得到 7 個梯度的系列對照品溶液，進高
效液相色譜儀測定，最后以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做四種物質(zhì)的標準曲
線。
（3）供試品溶液制備
水煮法制得黃連生藥濃度為 0.1 g·mL-1 的黃連溶液，再將該溶液在 12000 rpm
轉(zhuǎn)速下離心 20 min 除去不溶性雜質(zhì)，之后取上清液 1 mL 于 10 mL 容量瓶用流動
相定容，再次用 12000 rpm 離心 15 min 除去不溶于流動相的雜質(zhì)，最后用 0.22 μm
有機系濾膜過濾既得供試品溶液。
1.2.3 細菌培養(yǎng)
（1）細菌培養(yǎng) 將菌株置于 TSB 液體培養(yǎng)液中，37℃，130 rpm 恒溫培養(yǎng)振
蕩器中培養(yǎng)，待細菌長至對數(shù)生長期時進行試驗。
（2）細菌傳代 將長至對數(shù)期的細菌，2000 rpm 離心 3 min，棄上清，用 PBS
洗一次，離心，加入適量新鮮細菌培養(yǎng)液，重懸以適當比例傳代接種到 50 mL
新鮮培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng)。
（3）細菌凍存 將對數(shù)生長期的細菌，2000 rpm 離心 3 min，棄上清，用
PBS 洗一次，離心，新鮮的培養(yǎng)液懸浮，加等體積已備好的甘油水溶液，分裝于
1.5 mL 離心管中，標明細菌株種類和凍存日期，置于-20℃冰箱中保存。
（4）細菌復蘇 從-20℃里取出凍存菌種，待其解凍，用接種環(huán)挑一環(huán)至已15
備好的固體培養(yǎng)基中，四區(qū)劃線后放于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其長出
單菌落，用接種環(huán)挑取一個單菌落至新鮮培養(yǎng)基中進行活化。
1.2.4 MIC 的檢測
（1）菌液的準備 將凍存的痢疾桿菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進行復
蘇，待其有單菌落長出，接種于已備好的新鮮、無菌胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）
培養(yǎng)基中進行活化，待其培養(yǎng)至對數(shù)期，用 TSB 液體培養(yǎng)基將痢疾桿菌濃度調(diào)
節(jié)至 105-106 cfu·mL-1。
（2）樣品準備 配適當體積的固體培養(yǎng)基高壓滅菌后加入一定體積的黃連水
提液，然后半倍稀釋，使其含藥培養(yǎng)基的濃度為 0、1.25、2.5、5、10、20 mg·mL-1，
倒入以備好的無菌平板中，每個平板中 5 mL 為宜，待其冷卻凝固之后，分別接
上以備好的菌懸液 50 μL 用涂菌器涂抹均勻，在 37℃的培養(yǎng)箱下進行培養(yǎng)。
（3）樣品檢測 細菌檢測 24 h 后，觀察平板上菌種的生長情況，以培養(yǎng)基
上無菌生長的低濃度為黃連水提液的最小抑菌濃度。
1.2.5 痢疾桿菌生長曲線
（1）藥物處理 將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液
中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，無菌水為空白
對照組，37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng)；
（2）準備樣品 每隔 1 h 取各組樣品 2 mL，連續(xù)取 24 h；
（3）檢測樣品 用分光光度計測定在波長為 600 的各組吸光度 OD 值，取 3
次重復實驗的平均值。繪制黃連水提液作用后痢疾桿菌的生長曲線（OD 值為縱
坐標，時間為橫坐標）。
1.2.6 培養(yǎng)液中 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)的測定
（1）藥物處理 將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液
中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5mg·mL-1，10mg·mL-1，無菌水為空白對
照組，37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng)；
（2）樣品準備 連續(xù) 12 h 取各組樣品 2 mL，離心 10 min，4000 rpm，棄沉
淀留上清。
（3）檢測樣品 用紫外分光光度計測定上清液中 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)
的吸光度值，波長 260 nm。以無菌水為對照組，取 3 次重復實驗的平均值。
1.2.7 黃連對痢疾桿菌細胞壁的影響
將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌加入到含 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1
黃連的 TSB 液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基含菌體 107 cfu·mL-1，于 37℃、130 rpm 搖
床培養(yǎng)，以無菌作為對照組，分別在 0、2、4、6、8、10 和 12 h 定時取樣 5000 rpm，16
10 min 離心取上清，上清液按照表 1 加入 96 孔板中。
用酶標儀測定 96 孔板中各樣品在 520 nm 時的吸光度，并隨時間延長檢測各
時間點的吸光度變化情況，平行測定 3 次取平均值。按照公式計算 AKP 的含量
（堿性磷酸酶（金氏單位/100 mL）=[（測定孔-空白孔）/（標準空-空白孔）]×
酚標準品濃度（0.02 mg·mL-1）×100 mL）
1.2.8 黃連對痢疾桿菌呼吸代謝系統(tǒng)的影響
（1）黃連處理 將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液
中黃連的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，無菌水為空白對照組，
37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng) 10 h，每組設(shè)置三個平行；
（2）準備樣品 將培養(yǎng)的菌液 5000 rpm 離心 10 min，棄去上清液，
（3）處理樣品 用 0.1 mol·L Tris-HCl（pH7.4）緩沖液洗菌沉淀 2-3 次后，
加入等體積的溶菌溶液，37℃水浴 20 min 后，立即冰浴，再加入 Tris-SDS
（pH=9.0）緩沖液 1 mL，10000 rpm 低溫離心 15 min，取出上清液；
（4）檢測樣品 酶活性的測定按試劑盒說明書操作。蛋白定量方法參照
Bradford 法
toxin代 toxin代 toxin代 toxin北京試劑 toxin天津試劑 toxin上海試劑 toxin代廣東試劑 toxin 代南京試劑 toxin代湖北試劑 toxin代湖南試劑 toxin代黑龍江試劑 toxin代吉林試劑 toxin代上海試劑 toxin代廣州試劑 toxin系列全 toxin系列全 toxin系列全 toxin降價 toxin其他試劑 toxin其他試劑 toxin降價 toxin降價 toxin降價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin活動價 toxin降價 toxin降價 toxin降價 toxin試劑 toxin試劑 toxin試劑 toxin試劑 toxin試劑 toxin試劑 toxin試劑 toxin試劑 toxin北京現(xiàn)貨 toxin天津現(xiàn)貨 toxin河北現(xiàn)貨 toxin河南現(xiàn)貨 toxin廣東現(xiàn)貨 toxin廣州現(xiàn)貨 toxin上?，F(xiàn)貨 toxin湖北現(xiàn)貨 toxin湖南現(xiàn)貨 toxin內(nèi)蒙古現(xiàn)貨 toxin山西現(xiàn)貨 toxin山東現(xiàn)貨，618周年慶， toxin降價 toxin降價 toxin降價，歡迎選購 toxin 湖北試劑 toxin 湖北試劑
以下TOXIN 系列，一直現(xiàn)貨，價格美麗，TOXIN 擁有很多忠實用戶 TOXIN 擁有很多忠實用戶 TOXIN 擁有很多忠實用戶 TOXIN 選購 TOXIN 選購 TOXIN 選購
TOXIN 現(xiàn)貨 大力回饋新老客戶，現(xiàn)貨打折出售，現(xiàn)有品牌和種類，新老客戶可以自由選購： TOXIN 北京試劑 TOXIN 常見問題與解答 TOXIN 上海試劑 TOXIN 試劑 TOXIN 廣東試劑 TOXIN 深圳試劑 TOXIN 河北試劑 TOXIN 上海試劑 TOXIN 上海試劑 TOXIN 安徽試劑 TOXIN 河南試劑 tissue.Transnetyx天津試劑 TOXIN 代理， TOXIN 上海試劑 TOXIN 廣東試劑TOXIN 廣州試劑TOXIN 深圳試劑TOXIN 內(nèi)蒙古試劑 TOXIN 河南試劑 TOXIN 江蘇試劑 TOXIN 江西試劑TOXIN 湖北試劑TOXIN 湖南試劑TOXIN 安徽試劑TOXIN 蘇州試劑 TOXIN 杭州試劑TOXIN 浙江試劑 TOXIN 北京 TOXIN 制劑存儲 TOXIN 江蘇試劑 TOXIN 浙江試劑 TOXIN 江蘇試劑 TOXIN 江蘇試劑 TOXIN 廣州試劑 TOXIN 試劑選購 TOXIN 試劑選購
toxin代北京試劑 toxin代天津試劑toxin代上海試劑toxin代廣東試劑toxin代南京試劑toxin代湖北試劑toxin代湖南試劑 toxin代黑龍江試劑 toxin代吉林試劑 toxin代浙江試劑 toxin代江蘇試劑 toxin代江西試劑toxin代寧夏試劑toxin代河北試劑toxin代河南試劑toxin代山西試劑toxin代陜西試劑toxin代重慶試劑toxin代安徽試劑to