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RNA 在調(diào)控和基因表達(dá)中起重要作用，并在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用。因此，獲得充足且高質(zhì)量的植物RNA產(chǎn)量對(duì)許多生物科學(xué)領(lǐng)域至關(guān)重要。

植物 RNA 的幾個(gè)特征使其提取具有挑戰(zhàn)性。在本文中，我們將討論這些特征、RNA 的類型、植物 RNA 提取的主要步驟、如何量化產(chǎn)量和驗(yàn)證植物 RNA 的質(zhì)量，以及更好地提取植物 RNA 的一些技巧。

什么是RNA？

RNA是分子核糖核酸的縮寫。RNA是每個(gè)生物體非常重要的分子。它由四種類型的核糖核苷酸堿基組成，稱為腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G) 和尿嘧啶 (U)。有時(shí)，將 RNA 比作參考書上的副本（在這種情況下來(lái)自 DNA）。

RNA 是單鏈分子，含有核糖（而不是 DNA 中存在的脫氧核糖）。核糖含有用 OH 表示的羥基。這些羥基使 RNA 更具反應(yīng)性并易于水解，從而導(dǎo)致分子不穩(wěn)定并使其更容易降解。由于其不穩(wěn)定性，操作 RNA 時(shí)必須更加小心。

RNA的類型

在植物中，您可以識(shí)別三種主要類型的 RNA：

信使 RNA (mRNA)：一種轉(zhuǎn)錄 DNA 序列并編碼蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)產(chǎn)物的分子。

核糖體 RNA (rRNA)：這種 RNA 是核糖體結(jié)構(gòu)的一部分，對(duì)所有生物體的蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要。rRNA 構(gòu)成了核糖體中的主要物質(zhì)，按重量計(jì)大約為 60% 的 rRNA 和 40% 的蛋白質(zhì)。

轉(zhuǎn)移 RNA (tRNA)：這種類型的 RNA 分子將 mRNA 序列解碼為蛋白質(zhì)。tRNA 在翻譯（從 mRNA 分子合成蛋白質(zhì)的過程）期間在核糖體的特定位點(diǎn)發(fā)揮作用。

這三類RNA在每個(gè)細(xì)胞中所占的比例各不相同：mRNA約占總RNA的2.0-2.5%，tRNA約占14%，而絕大多數(shù)被rRNA占據(jù)（約80%）。正如您稍后將看到的，這些比例在確定 RNA 提取的質(zhì)量方面起著重要作用。

除了上面列出的 RNA，研究人員還在植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了許多其他類型的 RNA。

此外，還有一些 RNA 僅對(duì)植物具有特異性，例如葉綠體 RNA。

與在線粒體中發(fā)現(xiàn) RNA 的方式類似，葉綠體中也存在 RNA。這些細(xì)胞器（線粒體和葉綠體）中的 RNA 由內(nèi)共生理論解釋。該理論指出，真核細(xì)胞中的線粒體和葉綠體曾經(jīng)是被大型厭氧細(xì)菌攝取的需氧細(xì)菌。因此，植物具有三種*不同的 RNA：核、線粒體和葉綠體。

為什么提取植物RNA這么難？

植物 RNA 的問題在于提取通常會(huì)產(chǎn)生較低的 RNA 質(zhì)量和產(chǎn)量。

您可能知道，植物的細(xì)胞中有很多代謝物。它們含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和次生代謝物，僅舉幾例。

由于裂解步驟，所有這些代謝物在 RNA 提取過程中都變得混合，在此過程中必須破壞植物膜以釋放 RNA。

分離好的 RNA 的困難在于這些代謝物的大量存在。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上類似于核酸并與 RNA 共沉淀，從而降低了提取的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，氧化多酚（作為醌）等次級(jí)代謝物不可逆地與核酸結(jié)合并作為下游應(yīng)用的抑制劑或可能降解 RNA。

使植物 RNA 提取更加困難的其他一些條件包括：許多植物樣品中固有的高水平 RNases（降解 RNA）、低濃度的 RNA（由于含水量高）和纖維組織，如木質(zhì)素（木材) 難以分解和移除。

同樣，分離高質(zhì)量的 RNA 對(duì)下游應(yīng)用至關(guān)重要。

植物RNA的應(yīng)用

RNA 在許多不同的技術(shù)中非常有用，可以理解基因調(diào)控和表達(dá)。RNA 用于傳統(tǒng)應(yīng)用，例如：

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)，

定量 RT-PCR (RT-qPCR)

互補(bǔ) DNA 合成 (cDNA)

Northern印跡

對(duì)于高級(jí)方法，RNA 用于：

差分顯示 (DD)

抑制消減雜交 (SSH) 文庫(kù)構(gòu)建

RNA-Seq（研究特定條件下生物體中存在的所有RNA的轉(zhuǎn)錄組或集合）

染色質(zhì)免疫沉淀

新一代測(cè)序 (ChIP-Seq) 實(shí)驗(yàn)。

植物RNA的提取方法

已經(jīng)發(fā)布了數(shù)以千計(jì)的植物 RNA 提取方案。但是，大多數(shù)報(bào)告的協(xié)議都基于三種方法：

基于苯酚的方法：基于苯酚的方案主要用于具有高濃度次生代謝物的植物。苯酚通常與氯仿結(jié)合以去除多糖污染物。

基于 Trizol 的方法： Trizol 已被用于從特定組織（如擬南芥種子）中提取 RNA 。Trizol 是一種市售試劑，它在單一溶液中結(jié)合了苯酚和異硫氰酸胍，以便在快速分離過程中產(chǎn)生高產(chǎn)量的 RNA。在該方法中，trizol 與氯仿、異丙醇和乙醇在無(wú) RNase 的水中結(jié)合以去除污染物。

基于 CTAB 的方法：十六烷基基溴化銨或基于 CTAB 的方法已用于具有高多糖、次級(jí)產(chǎn)物或高水平 RNase 的植物樣品。CTAB 提取緩沖液基本上由 2% 十六烷基基溴化銨、1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl 和 20mM EDTA 組成。這種方法首先去除多糖，然后是蛋白質(zhì)，最后是次生代謝物。該方法還可以包括濃度約為 0.5% 的十二烷基硫酸鈉 (SDS)。SDS 是一種去污劑，可與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，有助于在提取過程中去除蛋白質(zhì)污染物。

植物RNA提取的主要步驟

大多數(shù) RNA 提取可以分為四個(gè)步驟：

均質(zhì)化：可以新鮮或冷凍獲得組織。此外，當(dāng)沒有合適的實(shí)驗(yàn)室條件時(shí)（如從現(xiàn)場(chǎng)工作中收獲），樣品可能會(huì)保存在高鹽溶液中，如“RNA 后期試劑"（室溫），直到在實(shí)驗(yàn)室中處理。使用新鮮或冷凍組織沒有一般規(guī)則，因?yàn)橐笕Q于實(shí)驗(yàn)和植物組織。然而，一旦樣品準(zhǔn)備好，它通常被放置在研缽中，并在研杵的幫助下，在加入緩沖提取溶液之前將組織研磨成細(xì)粉。在其他情況下，研究人員可以使用帶有珠子的均質(zhì)器，這有助于將組織粉碎成粉末。

分離：一旦組織變成細(xì)粉，加入緩沖液提取液。在這種情況下，可以使用任何苯酚、trizol 或 CTAB 緩沖液提取溶液。此步驟的目的是裂解細(xì)胞以釋放 RNA。然而，這是關(guān)于污染的關(guān)鍵步驟，因?yàn)楫?dāng)膜破裂時(shí)，所有細(xì)胞內(nèi)容物都會(huì)同時(shí)釋放。這意味著 RNA 與所有其他細(xì)胞成分結(jié)合，多糖和多酚等代謝物現(xiàn)在可以與 RNA 更緊密地接觸。同時(shí)，RNAses 也開始工作，從而增加了 RNA 降解的風(fēng)險(xiǎn)。一些提取溶液的作用類似于 RNA 酶抑制劑，可減少 RNA 損傷的機(jī)會(huì)。

清除：在此步驟中，使用不同的互補(bǔ)試劑去除污染物，例如多糖、蛋白質(zhì)和次級(jí)代謝物，以及其他可能的污染物。氯仿和異丙醇等試劑分別用于去除多糖/二級(jí)代謝物和蛋白質(zhì)。此外，污染的基因組 DNA 可以使用基于柱的或基于酶的方法去除。

沉淀：此步驟用于純化和清潔下游應(yīng)用最終溶液中的 RNA，并進(jìn)一步去除任何額外的污染物。在這里，乙醇 70%、用 0.1% (v/v) 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或無(wú) DNase 和無(wú) RNase 的水處理的水可用于保存提取的 RNA。最后，一旦 RNA 溶解在這些試劑之一中，RNA 必須儲(chǔ)存在 -80°C。

植物RNA提取的關(guān)鍵試劑

盡管在 RNA 中使用了許多解決方案，但在本文中，我們選擇了六種對(duì)大多數(shù) RNA 提取協(xié)議非常重要的試劑/解決方案。

裂解緩沖液：這是為了打破細(xì)胞膜并促進(jìn) RNA 的釋放。這通常是 Trizol、苯酚或 CTAB 緩沖液。

氯仿：這是一種通常用于去除多糖的試劑。一些協(xié)議建議使用氯仿進(jìn)行兩次洗滌以獲得更好的結(jié)果。

異丙醇：該試劑有助于去除蛋白質(zhì)。

乙醇：該試劑用于沉淀步驟。通常，RNA 在 70% 乙醇中沉淀。

無(wú) RNase 和 DNase 水：這些用于 RNA 協(xié)議所需的所有解決方案。此外，這種類型的水可以在市場(chǎng)上買到，也可以用 DEPC 處理過的水代替。DEPC 處理過的水是通過將一定體積的蒸餾水與 DEPC 試劑 (0.1% v/v) 混合來(lái)制備的。

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