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產品時間：2022-05-29
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Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
Catalog No. K1018
用于細胞增殖和細胞毒性試驗
Description
我們的產品Cell Counting Kit-8（CCK-8）相比以前的方法為細胞數測定和細胞增殖/毒性檢測提供了更方便和靈敏的方法。試劑盒使用了一種高水溶性的四唑鹽，WST-8，它在電子耦合試劑存在下還原產生水溶性formazan形式的染料。由脫氫酶產生的formazan的量與活細胞的數量呈直接的線性關系。CCK-8的檢測靈敏度高于其他方法，如MTT，XTT，MTS或WST-1等。
CCK-8法的優(yōu)勢
Features
比MTT，MTS或WST-1更敏感
對細胞無毒性
步驟更簡單，無需有機溶劑
穩(wěn)定的試劑，即用型
質量控制
Protocol
1.簡介
相比以前的方法如 MTT 檢測，Cell Counting Kit-8（CCK-8）為細胞數測定和細胞增殖/毒性測
定的研究提供了更方便和靈敏的方法。我們使用了一種高水溶性的四唑鹽，WST-8
[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodiu
m salt]，它在電子耦合試劑存在下還原產生水溶性 formazan 形式的染料，如 Figure. 1 所示。
Figure.1 WST-8 和 WST-8 formazan 結構
我們的產品 CCK-8 已經與電子耦合試劑混合，是即用型。WST-8 可被活細胞中豐富的脫氫酶
還原，轉化為 formazan 形式，這是一種可溶于培養(yǎng)基的橙色染料（Figure. 2）。脫氫酶產生
的 formazan 的量與活細胞的數量呈直接的線性關系。
Figure.2 檢測原理
CCK-8 試劑盒為細胞增殖和細胞毒性檢測中測定活細胞數提供了靈敏的比色檢測。以往的研
Protocol
究表明，CCK-8 的檢測靈敏度高于其他四唑鹽，如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1。由于 WST-8
formazan 是水溶性的，因此不再需要添加 DMSO 等有機溶劑。WST-8 formazan 在 450nm 處
的吸光度與培養(yǎng)基中活細胞的數量呈線性關系，活細胞數可以使用對應的吸光度值和標準曲
線確定。CCK-8 檢測也可以代替[3H]-thymidine 摻入檢測。
2.需要的的設備和材料
酶標儀 (450 nm 濾光片)
96 孔板
10 μl, 100-200 μl 多通道移液器
細胞 CO2培養(yǎng)箱
3.細胞活性檢測
3.1. 將細胞懸液（100 μl /孔）接種在 96 孔板中。在潮濕的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)一定時間（例如，
在 37℃，5％CO2下）。
3.2. 向板的每個孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入氣泡，因為它們會干擾
O.D. 值檢測。
3.3. 將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。
3.4. 使用酶標儀測量 450 nm 處的吸光度。
如果不立刻測量吸光度，可在每個孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，蓋好并在室溫下
避光保存。24 小時內不會觀察到吸光度變化。
4.細胞增殖/毒性檢測
4.1. 在 96 孔板中每孔接種 100 μl 細胞懸液（約 5000 個細胞/孔）。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預
培養(yǎng) 24 小時（例如，在 37℃，5％CO2下）。
4.2. 向孔中加入 10 μl 不同濃度的待測物質。
4.3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當的時間長度（例如，6, 12, 24 或 48 小時）。
4.4. 向板的每個孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入氣泡，因為它們會干擾
O.D. 值檢測。
4.5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。
4.6. 在讀取平板之前，可以在搖床上溫柔的混勻。然后使用酶標儀測量 450 nm 處的吸光度。
如果不立刻測量吸光度，可在每個孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，蓋好并在室溫下
避光保存。24 小時內不會觀察到吸光度變化。
5.數據分析
統(tǒng)計分析有幾種方法，您可以選擇使用 O.D.值或細胞數量，我們提供其中一種方法。
細胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =實驗孔吸光度（含有細胞，培養(yǎng)基，CCK-8 和待測化合物的孔的吸光度）
Ab =空白孔吸光度（含有培養(yǎng)基和 CCK-8 的孔的吸光度）
Ac =對照孔吸光度（含有細胞，培養(yǎng)基和 CCK-8 的孔的吸光度）
Protocol
6.制作標準曲線
6.1. 細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數
6.2. 使用培養(yǎng)基，等比稀釋細胞懸液為一個濃度梯度，通常需要 5-7 個濃度梯度，每組幾個
復孔。然后接種細胞。（注意每孔的細胞數量。如果您將細胞懸液稀釋在管中，在加入培養(yǎng)
板的孔之前，請小心再次混勻細胞。每孔中細胞懸液的體積應該是一致的。）
6.3. 培養(yǎng)直至細胞貼壁（通常 2-4 小時），然后每 100 μL 培養(yǎng)基加入 10 μL CCK-8。繼續(xù)孵育
1-4 小時，用酶標儀測量 450nm 處的吸光度。制作出一條以細胞數為 X 軸坐標，O.D.值為 Y
軸坐標的標準曲線。
可以基于該曲線確定待測樣品的細胞數。使用此標準曲線的先決條件是培養(yǎng)檢測條件相同。
7.注意事項
7.1. 確保藥物和 CCK-8 均勻分布在培養(yǎng)基中。
7.2. 細胞增殖越多, 顏色越深; 細胞毒性越強，顏色越淺。
7.3. 對于貼壁細胞，每孔至少需要 1000 個細胞（100 μl 培養(yǎng)基）。對于白細胞，由于靈敏度
較低，每孔至少需要 2500 個細胞（100 μl 培養(yǎng)基）。推薦的 96 孔板每孔最大細胞數為 25000.
如果使用 24 孔或 6 孔板進行該檢測，請計算相應的每孔的細胞數，并調整 CCK-8 的體積，
使其為每孔總液體體積的 10％。
7.4. 因為 CCK-8 測定是基于活細胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學物質可能
導致實際活細胞數與使用 CCK-8 測定活細胞數之間有差異。
7.5. WST-8 可能與還原劑反應生成 WST-8 formazan。如果使用還原劑 (例如一些抗氧化劑)會
干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。
7.6. 孵育 2 小時后，背景 O.D.值一般為 0.1-0.2 單位。
7.7. 注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾 O.D.值。
7.8. 如果您想對 CCK-8 溶液進行滅菌，請使用 0.2 μm 的膜過濾溶液。
7.9. 孵育時間因孔中細胞的類型和數量而異。通常，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的
孵育時間（長達 4 小時）或大量細胞（~105細胞/孔）。
7.10. 如果細胞懸液中存在高濁度, 測量并減去樣品在 600nm 或更高波長的 O.D 值。
7.11. CCK-8 不能用于細胞染色。
7.12. 培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中
本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
7.13. CCK-8的毒性非常低，在CCK-8測定完成后，相同的細胞可用于其他細胞增殖測定，例如
結晶紫測定，中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細胞極為稀少，不推薦。）
7.14. 該試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母細胞。
7.15. 在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。
7.16. 我們建議將細胞接種在靠近培養(yǎng)板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，
可以用PBS，水或培養(yǎng)基填充這些孔。
7.17. 如果您沒有 450 nm 濾光片。您也可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之間的濾光片, 450
nm 濾光片具有最佳靈敏度。
7.18. 測量 450 nm 處的吸光度，如果您需要進行雙波長測定，作為參考波長可以測定 650 nm
處的吸光度。
7.19. 藥物中金屬離子的存在可能會影響 CCK-8 的靈敏度。終濃度為 1 mM 的氯化亞鉛、氯
化鐵、硫酸銅會抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是 10 mM
的話，將會 100% 抑制。
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